Metode-Metode Pengujian Konvensional: Difusi Cawan
Karena semakin banyak agen antimikroba yang ditemukan untuk mengobati infeksi bakteri, kekurangan-kekurangan metode pengenceran kaldu-makro (macrobroth) semakin menjadi jelas. Sebelum teknologi pengenceran-mikro (micodillution) tersedia, metode yang lebih praktis dan lebih mudah untuk pengujian berbagai agen antimikroba terhadap turunan-turunan bakteri diperlukan. Diluar kebutuhan ini, uji difusi cawan dikembangkan, yang dilahirkan oleh penelitian Bauer, Kirby, Sherris, dan Turck pada tahun 1966. Mereka membakukan dan mengkorelasikan penggunaan cawan kertas saring yang dibubuhi antibiotik (yakni cawan antibiotik) dengan MIC yang menggunakan banyak turunan bakteri. Dengan menggunakan uji kerentanan difusi cawan, resistensi antimikroba dideteksi dengan menguji isolat-isolat bakteri menggunakan cawan-cawan antibiotik yang ditempatkan pada permukaan plat agar yang telah ditanami dengan bakteri.
Ketika cawan yang mengandung agen antimikroba dengan konsentrasi yang diketahui ditempatkan pada permukaan sebuah plat yang baru diinokulasi, maka agen ini akan segera berdifusi dan membentuk sebuah gradien konsentrasi di sekitar cawan kertas. Konsentrasi tertinggi adalah yang paling dekat dengan cawan. Selama inkubasi, bakteri tumbuh pada permukaan plat kecuali dimana konsentrasi antibiotik dalam gradien di sekitar masing-masing cawan cukup tinggi untuk menghambat pertumbuhannya. Setelah inkubasi, diameter zona inhibisi di sekitar masing-masing cawan diukur dalam milimeter (lihat Gambar 12-5).
Agar dapat menentukan titik henti (breakpoint) ukuran zona inhibisi referensi untuk menetapkan kategori “rentan”, “intermediat”, “kebal” bagi masing-masing kombinasi agen antimikroba dan spesies, ratusan turunan diuji. Ukuran zona inhibisi yang diperoleh kemudian dikorelasikan dengan MIC yang didapatkan dengan kaldu atau pengenceran agar, dan sebuah analisis regresi (yakni, garis yang paling mewakili) dilakukan dengan memplotkan zona ukuran dalam satuan milimeter terhadap MIC (Gambar 12-6). Ketika MIC turunan bakteri yang diuji meningkat (yakni, turunan bakteri yang lebih resisten/kebal), ukuran zona inhibisi yang bersangkutan (yakni diameter) akan berkurang. Dengan gambar 12-6 sebagai ilustrasi, garis-garis horizontal digambar dari titik henti (breakpoint) resisten MIC dan titik henti MIC rentan”, masing-masing 8 µg/mL dan 2 µg/mL. Pada tempat dimana garis-garis horizontal berpotongan dengan garis regresi, garis-garis vertikal digambar untuk menunjukkan titik-henti ukuran zona inhibisi yang bersangkutan (dalam milimeter). Dengan menggunakan pendekatan ini, kriteria interpretasi ukuran zona telah ditentukan untuk kebanyakan agen antimikroba yang umum diuji dan telah dipublikasikan dalam seri CLSI M02 yang berjudul “Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests.”
Prosedur. Karakteristik penting dari prosedur pengujian difusi cawan ditunjukkan pada Tabel 12-3.
Medium dan Agen Antimikroba. Agar Mueller-Hinton merupakan medium basis agar standar untuk pengujian sebagian besar organisme bakteri, dengan suplemen dan substitusi tertentu yang diperlukan untuk pengujian organisme yang lebih rumit. Disamping faktor-faktor seperti pH dan kandungan kation, kedalaman medium agar juga bisa mempengaruhi keakuratan uji dan harus dikontrol secara cermat. Karena agen-agen antimikroba berdifusi ke segala arah dari permukaan plat agar, maka ketebalan agar mempengaruhi gradien konsentrasi obat antimikroba. Jika agar terlalu tebal, ukuran zona akan menjadi lebih kecil; jika terlalu tipis, zona inhibisi akan lebih besar. Bagi kebanyakan laboratorium yang melakukan difusi cawan, pabrik-pabrik komersial merupakan sumber yang terpercaya untuk plat-plat Mueller-Hinton yang dibuat dan dikontrol dengan baik.
Konsentrasi obat yang pas untuk setiap cawan ditentukan oleh FDA. Cawan bisa diperoleh dari berbagai perusahaan yang memproduksi dan harus disimpan pada suhu -20oC dalam desikator sampai digunakan. Cawan yang mencair dan tidak terpakai bisa disimpan pada suhu 4oC selama sampai satu pekan. Penyimpanan yang tidak sesuai bisa mengarah pada rusaknya agen-agen antimikroba dan memberikan hasil ukuran zona inhibisi yang menyesatkan.
Untuk memastikan difusi obat yang sebanding ke dalam agar, cawan harus ditempatkan secara datar pada permukaan dan diaplikasikan dengan kuat untuk memastikan perlekatan. Ini dapat dicapai dengan menggunakan salah satu dari beberapa penuang cawan yang tersedia secara komersial. Dengan alat-alat penuang/penyalur ini (dispenser), semua cawan dalam wadah uji disalurkan secara simultan ke permukaan agar yang diinokulasi dan diberi jarak yang cukup untuk meminimalisir timpang-tindih antara zona inhibisi dan interaksi yang signifikan antara antimikroba. Pada kebanyakan kasus, maksimal 12 cawan antibiotik bisa diaplikasikan ke permukaan satu plat agar Mueller-Hinton 150-mm (lihat Gambar 12-5).
Inokulasi dan Inkubasi. Sebelum pemasangan cawan, permukaan plat diinokulasi dengan menggunakan sebuah gulungan kapas yang telah dicelupkan dalam sebuah suspensi bakteri yang dibakukan untuk memenuhi standar kekeruhan 0,5 McFarland (yakni 1,5 x 108 CFU/mL). Permukaan plat diseka dalam tiga arah untuk memastikan distribusi inokulum yang merata dan utuh pada seluruh agar. Dalam waktu 15 menit inokulasi, cawan-cawan agen antimikroba diaplikasikan dan plat-plat dibalik untuk inbukasi agar menghindari akumulasi kelembaban pada permukaan agar yang bisa mengganggu interpretasi hasil tes.
Bagi kebanyakan organisme, inkubasi dilakukan pada 35oC di udara, tetapi CO2 yang meningkat digunakan menguji bakteri tertentu yang rumit (lihat Tabel 12-3). Demikian juga, waktu inkubasi bisa ditingkatkan lebih dari 16 jam untuk meningkatkan pendeteksian pola-pola resistensi tertentu (seperti resistensi meticillin pada staphylococci dan resistensi vancomycin pada enterococci) dan untuk memastikan hasil-hasil akurat secara umum untuk organisme ruwet tertentu seperti N. Gonorrhoeae.
Dinamika dan penentuan waktu difusi agen antimikroba untuk menentukan sebuah gradien konsentrasi bersama dengan pertumbuhan organisme selama durasi 18-24 jam penting untuk hasil yang terpercaya. Dengan demikian, inkubasi plat-plat difusi cawan melebihi waktu yang telah ditentukan harus dihindari dan difusi cawan pada umumnya bukan metode yang berterima untuk pengujian organisme-organisme yang memerlukan masa inkubasi lama untuk tumbuh.
Pembacaan dan Interpretasi Hasil. Sebelum hasil pada cawan agen antimikroba dibaca, plat diuji untuk menguatkan bahwa bidang pertumbuhan yang baik dan berdekatan telah didapatkan (lihat Gambar 12-5). Jika pertumbuhan antara zona-zona inhibisi di sekitar masing-masing cawan buruk dan tidak berhimpitan, maka uji tidak boleh diinterpretasi dan harus diulangi. Kurangnya pertumbuhan yang berdekatan bisa disebabkan oleh inokulum yang tidak mencukupi. Atau, isolat tertentu bisa telah mengalami mutasi sehingga faktor-faktor pertumbuhan yang disuplai oleh medium pengujian kerentanan standar tidak lagi cukup untuk mendukung pertumbuhan kuat. Untuk kasus terakhir ini, medium yang disupplementasi dengan darah dan/atau inkubasi dalam CO2 bisa meningkatkan pertumbuhan. Akan tetapi, tindakan hati-hati dalam menginterpretais hasil diperlukan ketika tindakan-tindakan di luar standar digunakan untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik dan ketika medium standar yang direkomendasikan untuk pengujian tipe organisme tertentu tidak digunakan. Plat-plat juga harus diuji kemurniannya karena kultur-kultur yang dicampur paling terbukti sebagai morfologi-morfologi koloni berbeda yang tersebar pada area bakteri yang sedang diuji (Gambar 12-7). Kultur campuran memerlukan pemurnian dan uji berulang terhadap isolat bakteri yang diinginkan.
Dengan menggunakan latar yang gelap dan cahaya pantulan (Gambar 12-8), plat ditempatkan sedemikian rupa sehingga sebuah mistar atau kaliper bisa digunakan untuk mengukur diameter zona inhibisi untuk masing-masing agen antimikroba. Organisme-organisme motil tertentu, seperti Proteus spp. bisa berkerumun pada permukaan plat dan mempersulit interpretasi batas-batas zona secara jelas. Jika ini terjadi, kekaburan akibat kerumunan organisme diabaikan dan zona diukur pada titik dimana pertumbuhan secara mutlak terhambat. Demikian juga, kekaburan pertumbuhan bakteri bisa diamati ketika menguji sulfonamida dan trimethoprim sebagai akibat dari populasi organisme yang mengalami beberapa penggandaan generasi sebelum inhibisi; kekaburan pertumbuhan yang dihasilkan harus diabaikan untuk interpretasi cawan dengan agen-agen ini.
Pada kasus yang tidak melibatkan organisme pengabur atau pengujian sulfonamida dan trimethoprim, kekaburan-kekaburan pertumbuhan yang terjadi dalam zona inhibisi yang lebih jelas tidak boleh diabaikan. Pada banyak kasus, ini merupakan satu-satunya cara dimana pola-pola resistensi yang relevan secara klinis ditunjukkan oleh isolat-isolat bakteri tertentu ketika diuji dengan menggunakan metode difusi cawan. Contoh-contoh penting dimana ini dapat terjadi mencakup resistensi cephalosporin diantara beberapa spesies Enterobacteriaceae, resistensi methicillin pada staphylococci dan resistensi vancomycin pada beberapa enterococci. Sebetulnya, pendeteksian keburaman yang dihasilkan oleh beberapa staphylococci dan enterococci bisa dicapai paling baik dengan menggunakan sinar yang dipancarkan, bukan sinar pantulan. Pada kasus-kasus ini, plat-plat difusi cawan ditempatkan di depan sumber cahaya ketika zona inhibisi methicillin dan vancomycin sedang dibaca (lihat Gambar 12-8). Resistensi yang signifikan lainnya bisa terbukti dan tampak sebagai koloni-koloni individual dalam zona inhibisi yang jelas (Gambar 12-9). Ketika koloni-koloni seperti ini terlihat, kemurnian isolat tes harus dikonfirmasikan. Jika kemurnian dibuktikan, koloni-koloni individual merupakan varian atau mutan kebal dari spesies yang sama dan isolat uji harus dianggap resisten atau kebal.
Ketika ukuran zona telah dicatat, kategori-kategori interpretasi diberikan. Kriteria interpretasi untuk kombinasi antara agen antimikroba dan orgnaisme yang bisa diuji dengan difusi cawan diberikan dalam seri CLSI-M2 yang berujudul “Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Test (M100 supplements).” Penentuan mikroorganisme sebagai rentan, sedang, dan kebal, sama seperti yang digunakan metode pengenceran (lihat Box 12-2). Sebagai contoh, dengan menggunakan standar-standar interpretasi CLSI, sebuah isolat E. coli yang menghasilkan diameter zona inhibisi ampicillin 13 mm atau kurang dikelompokkan sebagai kebal; jika zona berukuran 14 hingga 16 mm, isolat dianggap sedang terhadap ampicillin; jika zona berukuran 17 mm atau lebih, organisme dianggap rentan.
Berbeda dengan MIC, ukuran zona inhibisi hanya digunakan untuk menghasilkan interpretasi kategori dan tidak memiliki utilitas klinis. Dengan demikian, ketika uji dilakukan dengan metode difusi cawan, hanya interpretasi rentan, sedang, atau kebal, yang dilaporkan.
Ketika cawan yang mengandung agen antimikroba dengan konsentrasi yang diketahui ditempatkan pada permukaan sebuah plat yang baru diinokulasi, maka agen ini akan segera berdifusi dan membentuk sebuah gradien konsentrasi di sekitar cawan kertas. Konsentrasi tertinggi adalah yang paling dekat dengan cawan. Selama inkubasi, bakteri tumbuh pada permukaan plat kecuali dimana konsentrasi antibiotik dalam gradien di sekitar masing-masing cawan cukup tinggi untuk menghambat pertumbuhannya. Setelah inkubasi, diameter zona inhibisi di sekitar masing-masing cawan diukur dalam milimeter (lihat Gambar 12-5).
Agar dapat menentukan titik henti (breakpoint) ukuran zona inhibisi referensi untuk menetapkan kategori “rentan”, “intermediat”, “kebal” bagi masing-masing kombinasi agen antimikroba dan spesies, ratusan turunan diuji. Ukuran zona inhibisi yang diperoleh kemudian dikorelasikan dengan MIC yang didapatkan dengan kaldu atau pengenceran agar, dan sebuah analisis regresi (yakni, garis yang paling mewakili) dilakukan dengan memplotkan zona ukuran dalam satuan milimeter terhadap MIC (Gambar 12-6). Ketika MIC turunan bakteri yang diuji meningkat (yakni, turunan bakteri yang lebih resisten/kebal), ukuran zona inhibisi yang bersangkutan (yakni diameter) akan berkurang. Dengan gambar 12-6 sebagai ilustrasi, garis-garis horizontal digambar dari titik henti (breakpoint) resisten MIC dan titik henti MIC rentan”, masing-masing 8 µg/mL dan 2 µg/mL. Pada tempat dimana garis-garis horizontal berpotongan dengan garis regresi, garis-garis vertikal digambar untuk menunjukkan titik-henti ukuran zona inhibisi yang bersangkutan (dalam milimeter). Dengan menggunakan pendekatan ini, kriteria interpretasi ukuran zona telah ditentukan untuk kebanyakan agen antimikroba yang umum diuji dan telah dipublikasikan dalam seri CLSI M02 yang berjudul “Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests.”
Prosedur. Karakteristik penting dari prosedur pengujian difusi cawan ditunjukkan pada Tabel 12-3.
Medium dan Agen Antimikroba. Agar Mueller-Hinton merupakan medium basis agar standar untuk pengujian sebagian besar organisme bakteri, dengan suplemen dan substitusi tertentu yang diperlukan untuk pengujian organisme yang lebih rumit. Disamping faktor-faktor seperti pH dan kandungan kation, kedalaman medium agar juga bisa mempengaruhi keakuratan uji dan harus dikontrol secara cermat. Karena agen-agen antimikroba berdifusi ke segala arah dari permukaan plat agar, maka ketebalan agar mempengaruhi gradien konsentrasi obat antimikroba. Jika agar terlalu tebal, ukuran zona akan menjadi lebih kecil; jika terlalu tipis, zona inhibisi akan lebih besar. Bagi kebanyakan laboratorium yang melakukan difusi cawan, pabrik-pabrik komersial merupakan sumber yang terpercaya untuk plat-plat Mueller-Hinton yang dibuat dan dikontrol dengan baik.
Konsentrasi obat yang pas untuk setiap cawan ditentukan oleh FDA. Cawan bisa diperoleh dari berbagai perusahaan yang memproduksi dan harus disimpan pada suhu -20oC dalam desikator sampai digunakan. Cawan yang mencair dan tidak terpakai bisa disimpan pada suhu 4oC selama sampai satu pekan. Penyimpanan yang tidak sesuai bisa mengarah pada rusaknya agen-agen antimikroba dan memberikan hasil ukuran zona inhibisi yang menyesatkan.
Untuk memastikan difusi obat yang sebanding ke dalam agar, cawan harus ditempatkan secara datar pada permukaan dan diaplikasikan dengan kuat untuk memastikan perlekatan. Ini dapat dicapai dengan menggunakan salah satu dari beberapa penuang cawan yang tersedia secara komersial. Dengan alat-alat penuang/penyalur ini (dispenser), semua cawan dalam wadah uji disalurkan secara simultan ke permukaan agar yang diinokulasi dan diberi jarak yang cukup untuk meminimalisir timpang-tindih antara zona inhibisi dan interaksi yang signifikan antara antimikroba. Pada kebanyakan kasus, maksimal 12 cawan antibiotik bisa diaplikasikan ke permukaan satu plat agar Mueller-Hinton 150-mm (lihat Gambar 12-5).
Inokulasi dan Inkubasi. Sebelum pemasangan cawan, permukaan plat diinokulasi dengan menggunakan sebuah gulungan kapas yang telah dicelupkan dalam sebuah suspensi bakteri yang dibakukan untuk memenuhi standar kekeruhan 0,5 McFarland (yakni 1,5 x 108 CFU/mL). Permukaan plat diseka dalam tiga arah untuk memastikan distribusi inokulum yang merata dan utuh pada seluruh agar. Dalam waktu 15 menit inokulasi, cawan-cawan agen antimikroba diaplikasikan dan plat-plat dibalik untuk inbukasi agar menghindari akumulasi kelembaban pada permukaan agar yang bisa mengganggu interpretasi hasil tes.
Bagi kebanyakan organisme, inkubasi dilakukan pada 35oC di udara, tetapi CO2 yang meningkat digunakan menguji bakteri tertentu yang rumit (lihat Tabel 12-3). Demikian juga, waktu inkubasi bisa ditingkatkan lebih dari 16 jam untuk meningkatkan pendeteksian pola-pola resistensi tertentu (seperti resistensi meticillin pada staphylococci dan resistensi vancomycin pada enterococci) dan untuk memastikan hasil-hasil akurat secara umum untuk organisme ruwet tertentu seperti N. Gonorrhoeae.
Dinamika dan penentuan waktu difusi agen antimikroba untuk menentukan sebuah gradien konsentrasi bersama dengan pertumbuhan organisme selama durasi 18-24 jam penting untuk hasil yang terpercaya. Dengan demikian, inkubasi plat-plat difusi cawan melebihi waktu yang telah ditentukan harus dihindari dan difusi cawan pada umumnya bukan metode yang berterima untuk pengujian organisme-organisme yang memerlukan masa inkubasi lama untuk tumbuh.
Pembacaan dan Interpretasi Hasil. Sebelum hasil pada cawan agen antimikroba dibaca, plat diuji untuk menguatkan bahwa bidang pertumbuhan yang baik dan berdekatan telah didapatkan (lihat Gambar 12-5). Jika pertumbuhan antara zona-zona inhibisi di sekitar masing-masing cawan buruk dan tidak berhimpitan, maka uji tidak boleh diinterpretasi dan harus diulangi. Kurangnya pertumbuhan yang berdekatan bisa disebabkan oleh inokulum yang tidak mencukupi. Atau, isolat tertentu bisa telah mengalami mutasi sehingga faktor-faktor pertumbuhan yang disuplai oleh medium pengujian kerentanan standar tidak lagi cukup untuk mendukung pertumbuhan kuat. Untuk kasus terakhir ini, medium yang disupplementasi dengan darah dan/atau inkubasi dalam CO2 bisa meningkatkan pertumbuhan. Akan tetapi, tindakan hati-hati dalam menginterpretais hasil diperlukan ketika tindakan-tindakan di luar standar digunakan untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik dan ketika medium standar yang direkomendasikan untuk pengujian tipe organisme tertentu tidak digunakan. Plat-plat juga harus diuji kemurniannya karena kultur-kultur yang dicampur paling terbukti sebagai morfologi-morfologi koloni berbeda yang tersebar pada area bakteri yang sedang diuji (Gambar 12-7). Kultur campuran memerlukan pemurnian dan uji berulang terhadap isolat bakteri yang diinginkan.
Dengan menggunakan latar yang gelap dan cahaya pantulan (Gambar 12-8), plat ditempatkan sedemikian rupa sehingga sebuah mistar atau kaliper bisa digunakan untuk mengukur diameter zona inhibisi untuk masing-masing agen antimikroba. Organisme-organisme motil tertentu, seperti Proteus spp. bisa berkerumun pada permukaan plat dan mempersulit interpretasi batas-batas zona secara jelas. Jika ini terjadi, kekaburan akibat kerumunan organisme diabaikan dan zona diukur pada titik dimana pertumbuhan secara mutlak terhambat. Demikian juga, kekaburan pertumbuhan bakteri bisa diamati ketika menguji sulfonamida dan trimethoprim sebagai akibat dari populasi organisme yang mengalami beberapa penggandaan generasi sebelum inhibisi; kekaburan pertumbuhan yang dihasilkan harus diabaikan untuk interpretasi cawan dengan agen-agen ini.
Pada kasus yang tidak melibatkan organisme pengabur atau pengujian sulfonamida dan trimethoprim, kekaburan-kekaburan pertumbuhan yang terjadi dalam zona inhibisi yang lebih jelas tidak boleh diabaikan. Pada banyak kasus, ini merupakan satu-satunya cara dimana pola-pola resistensi yang relevan secara klinis ditunjukkan oleh isolat-isolat bakteri tertentu ketika diuji dengan menggunakan metode difusi cawan. Contoh-contoh penting dimana ini dapat terjadi mencakup resistensi cephalosporin diantara beberapa spesies Enterobacteriaceae, resistensi methicillin pada staphylococci dan resistensi vancomycin pada beberapa enterococci. Sebetulnya, pendeteksian keburaman yang dihasilkan oleh beberapa staphylococci dan enterococci bisa dicapai paling baik dengan menggunakan sinar yang dipancarkan, bukan sinar pantulan. Pada kasus-kasus ini, plat-plat difusi cawan ditempatkan di depan sumber cahaya ketika zona inhibisi methicillin dan vancomycin sedang dibaca (lihat Gambar 12-8). Resistensi yang signifikan lainnya bisa terbukti dan tampak sebagai koloni-koloni individual dalam zona inhibisi yang jelas (Gambar 12-9). Ketika koloni-koloni seperti ini terlihat, kemurnian isolat tes harus dikonfirmasikan. Jika kemurnian dibuktikan, koloni-koloni individual merupakan varian atau mutan kebal dari spesies yang sama dan isolat uji harus dianggap resisten atau kebal.
Ketika ukuran zona telah dicatat, kategori-kategori interpretasi diberikan. Kriteria interpretasi untuk kombinasi antara agen antimikroba dan orgnaisme yang bisa diuji dengan difusi cawan diberikan dalam seri CLSI-M2 yang berujudul “Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Test (M100 supplements).” Penentuan mikroorganisme sebagai rentan, sedang, dan kebal, sama seperti yang digunakan metode pengenceran (lihat Box 12-2). Sebagai contoh, dengan menggunakan standar-standar interpretasi CLSI, sebuah isolat E. coli yang menghasilkan diameter zona inhibisi ampicillin 13 mm atau kurang dikelompokkan sebagai kebal; jika zona berukuran 14 hingga 16 mm, isolat dianggap sedang terhadap ampicillin; jika zona berukuran 17 mm atau lebih, organisme dianggap rentan.
Berbeda dengan MIC, ukuran zona inhibisi hanya digunakan untuk menghasilkan interpretasi kategori dan tidak memiliki utilitas klinis. Dengan demikian, ketika uji dilakukan dengan metode difusi cawan, hanya interpretasi rentan, sedang, atau kebal, yang dilaporkan.
Comments
Post a Comment